L'humanisme i la Reforma van marcar els destins de la catedral de València al llarg del segle XVI, etapa decisiva per a la història diocesana particularment i per a l'Església universal en general. Amb la Seu elevada feia poc al rang de metropolitana pel papa Alexandre VI, el seu capítol era un destí privilegiat per als cabalers de llinatges il·lustres de la mitjana i baixa noblesa autòctona i les oligarquies ciutadanes, perpetuades a través de les xarxes clientelistes i el patronatge. Açò explicaria la implicació del clergat catedralici en les bandositats, que aglutinaren la societat valenciana durant part de la centúria, en la qual el capítol catedralici funcionà de manera pràcticament autònoma gràcies a la fortalesa de què aquestes corporacions continuaven presumint. De segur, influïren també en el panorama descrit la incúria i l'absentisme episcopal de la família Borja i els membres de la Casa Reial, que caracteritzaren les dècades prèvies al pontificat de sant Tomàs de Villanueva, primer d'una sèrie de bisbes reformistes que, des de mitjan cinc-cents, trobarien entre aquests murs l'oposició principal a les polítiques centralitzadores.
No menys complicades es van demostrar les relacions capitulars amb altres actors, ja religiosos, com parròquies i ordes regulars, ja civils, especialment el Municipi, l'Audiència o els virreis, sense oblidar tampoc la recentment establida Inquisició: tots conflictes de poder en què el capítol es jugava el manteniment del seu estatus privilegiat en els temps moderns. Amb aquest afany, dignitats i canonges es decantarien majoritàriament per la Corona durant la pitjor crisi política del moment, que foren les Germanies. La monarquia en va premiar molts d'ells en paga d'aquests i altres serveis. N'hi hauria, fins i tot, que passaren a formar part del renovat episcopat hispànic, les bases dels quals posaren els Reis Catòlics, i Carles I i Felip II es van encarregar d'implementar.
De la mateixa manera, la catedral de València va participar del marc de llibertat intel·lectual que, en el primer terç del segle, possibilitaria el desenvolupament de la ciència i la cultura locals amb la popularització de la impremta i l'ajuda de la Universitat, creada en 1499 amb una presència notable en el claustre de prebendats il·lustres abans de la creació de les càtedres pabordies, que d'ara endavant vincularien les dos institucions. En aquest context, per tant, l'humanisme tingué repercussió en el temple metropolità, almenys fins que la por al protestantisme portara amb si una ortodòxia fèrria que afebliria el desenvolupament de les idees durant la resta de la centúria i reduiria la faena intel·lectual als esforços personals d'alguns capitulars. Mentrestant, aniria obrint-se pas la reforma afavorida per Trento en relació al clergat, encara que també en la transmissió del missatge cristià als fidels a través del culte, la litúrgia o la predicació.
Aquesta evolució aniria acompanyada del desenvolupament d'un espai catedralici concorde als nous temps i en adaptació constant a les diferents sensibilitats artístiques. L'esplendor del tardogòtic inicial, la seguirien les maneres renaixentistes, italianitzants primer arribades a València de la mà de diversos canonges al servei de l'últim papa Borja i naturalitzades després en el temple metropolità. Una cosa semblant ocorregué amb l'escultura, la pintura i les arts menors, la sumptuositat i els autors de les quals no van envejar res als de la fàbrica arquitectònica de la Seu.
